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发布时间:2019-05-30   点击次数:229次
疏水色谱柱是利用样品分子与固定相的疏水力作用的不同,用流动相洗脱时,各组分迁移速度不同而达到分离的目的。流动相一般为pH 6-8的盐水溶液,具有对蛋白质的回收率高,蛋白质变性可能性小等优势。由于流动相中不使用有机溶剂,也有利于蛋白质保持固有的活性。
 
疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过滤层析等技术,使该技术与后两者经常联合使用来分离复杂的生物样品。目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面,成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组蛋白等,以及一些药物分子,甚至细胞等分离时的有效手段。
 
疏水色谱柱的影响因素有哪些?
 
1、盐类和盐组成
盐的摩尔表面张力增大,蛋白质在疏水层析柱内的吸附能力相应增大。各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列的能力。 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸附能力具有最为重大的影响。选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。
 
2、离子强度
离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般增加离子强度来增加组分的保留值,降低离子强度来提高组分的解析附能力。
HIC实验中,改变离子强度进行洗脱的方式,一般宜采用梯度洗脱法,可提高分离的选择性。
 
3、溶液的酸碱度
溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。一般情况,溶液的pH接近蛋白质的等电点,其疏水性增加,有利于与固定相配基相互作用;远离其等电点,其疏水性减少,不利于与固定相配基结合,但有利于蛋白质洗脱。因此通过改变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。
 
4、柱温
一般柱温升高,生物大分子的构象会发生变化,疏水作用增加,吸附能力增加,有利于提高层析柱的分离度,所以有时可以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用,分离性质相近的化合物,如对分离一些小分子是非常有效的。但是对于具有生物活性的物质或酶类,在高温条件下易变性失活,因此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。
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