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消除TSK凝胶色谱柱脱水现象的正确步骤
发布时间:2018-01-23   点击次数:394次
TSK凝胶色谱柱的脱水现象,可能是因为使用不当或长期放置保存过程中造成的。有些TSK凝胶色谱柱中由于没有气密密封圈,这种情况下色谱柱会随时间而易发生干燥现象。对于其他的所有种类色谱柱如不锈钢或玻璃柱等,如果柱栓未拧紧或者使用过程中空气意外进入到色谱柱中,均可能发生柱子干燥的情况。很容易就可以辨认到玻璃色谱柱出现的脱水现象,因为可以很容易地看到干燥的填充物与柱壁分离的现象。我们推荐采用下列步骤,以消除TSK凝胶色谱柱的脱水现象:
1. 按照相反的流动方向将色谱柱连接到液相系统上;
2. 不要将色谱柱与检测器相连;
3. 以推荐zui大流速的一半流速,使用滤过的20%乙醇超纯水溶液进行色谱柱的过柱;
注意:反相色谱柱需要使用60%的乙醇。
4. 继续重复上述程序,直到您确信色谱柱已经再水化处理完毕。再水化处理可能需要
几个小时的时间,这取决于色谱柱的尺寸大小;
5. 按照正确的流动方向将色谱柱连接到液相系统上;
6. 如果有机物不是正常流动相的一部分的话,要使用3个柱体积的超纯水冲洗色谱柱
以去除有机物;
7. 使用上样缓冲液进行柱平衡(通常使用3——5个柱体积);
8. 使用QC 测试方法评价柱子的性能,以确保色谱柱能够正常使用。
除盐:对普通反相 C18 键合相柱,为除去柱中含有的缓冲盐类或水溶性物质时,不应使用纯水冲洗。因为 C18 键合相像一条长链将硅胶黏结,当有有机溶剂存在时,其表面被流动相润湿, C18 长链完全展开,像海水中的海藻一样。当纯水或缓冲溶液通过时, C18 键合相不能被浸润,键合相表面会塌陷,从而将溶剂、样品分子或无机盐分子包合。此时仅用纯水无法将包合物洗脱出,应使用含 5 %有机溶剂的水溶液冲洗,以清除无机盐或水溶性物质。
蛋白污染:如果需从硅胶键合固定相清洗蛋白质残留物,必须使用和前述不同的程序。如果生物材料血浆或血清样品注入色谱柱,在大多数情况下,纯有机溶剂 ( 如乙腈或甲醇 ) 并不能溶解肽和蛋白质,用它们清洗色谱柱是无效的。然而,有时使用有机溶剂与缓冲物、酸或离子对试剂的混合物却是有效的。
由于污染物聚集在色谱柱头,逆向冲洗会缩短污染物在柱中迁移的距离;又因为色谱柱皆在高于操作压力下填充的,通常逆向液流不会扰动色谱柱床。但如果色谱柱顶端过滤筛板的孔径大于柱底部过滤筛板的孔径,则固定相的微小粒子会在逆向冲洗过程通过筛板流出柱,从而会在柱中产生新的死空间引起柱床松动。因此在逆向冲洗前,应先确认柱管两端过滤筛板的孔径一致。
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